ニコンの超解像顕微鏡に関して

※以下に掲載している顕微鏡画像や動画の無断使用は、禁止いたします。

光学顕微鏡の限界を超えて。

　光学顕微鏡では、光が「波の性質」を持つことによる、約200nmという（光学的）分解能の限界があります。そのためこれ以上は、どれだけレンズをたくさん挿入しても、またはズームで拡大しても、詳細な構造を見ることはできません。

　※ただし200nm以下の物体でも、暗い中で明るく光っていれば見ることは可能です（遥か遠方の星も、夜空では見えることをイメージしてください）。「分解能」は、「見ることができる最小の物体のサイズ」ではなく、「２つの物体を分けて見ることができる限界」になります。そのため分子１個は数ナノ程度のサイズであっても、顕微鏡やカメラなどの性能が大幅に向上する以前より、「１分子観察で分子１個を観る」ことが可能でしたが、このためには励起光が届く領域を大きく制限するため、全反射蛍光光学系（TIRF)とすることが必須でした。
　分解能に関して、更に詳細を知りたいならば、[Optical Microscopy Primer: Numerical Aperture and Resolution]（Fig.3など）や、[Nikon: The Diffraction Barrier in Optical Microscopy]などを参照ください。どちらも英語ですが、分解能の定義や対物レンズのことも詳細に記してあるため、参考になります。

　一方で各種の電子顕微鏡（SEM, TEMなど）は、光学顕微鏡よりずっと高分解能で、ナノレベルでの構造観察も可能です。ただし真空下で電子線を照射する方法上、生きた細胞サンプルには使えず、”ある瞬間を固定したサンプルの様子”となってしまいます。このため生きている細胞の内部で起こる生物現象を、リアルタイムに観察することはできません。また電子顕微鏡で優れた画像を取得するには、サンプル作成や観察には熟練したテクニックを要し、研究者が「思いついたときに、簡単に」画像を取る手法とは言いにくいです。

　そのため近年になって各顕微鏡メーカーでは、”光の当て方”を工夫することで、更なる分解能で観察を行う「超解像顕微鏡」の開発を行っており、平成26年のノーベル化学賞の受賞もあって、非常に大きな注目を集めております。

ニコンの超解像顕微鏡：N-SIMに関して

構造化照明型超解像顕微鏡：N-SIMの概略

　ニコンでは独自の「構造化照明」による観察法を開発し、これにより空間分解能を従来の光学顕微鏡の約２倍（約120nm）程度に向上させ、生細胞内の微細構造の可視化を実現した超解像顕微鏡システム「N-SIM」を発売しております。他の超解像観察法では更に分解能が高い手法もありますが、このN-SIMは比較的高速で画像取得が可能で、光ダメージが弱いという特長から、タイムラプス観察に向いています。当センターのN-SIMには、405/488/561/640の４本のレーザーが搭載されており、これに対応するスタンダードなBlue, Green, Red, Deep-Redの蛍光なら観察が可能であるというのも、大きな長所です。またＺ方向分解能についても、一般の光学顕微鏡の限界の500nmから、約300nmまで高めることが可能で、Ｚ方向に一層明瞭な画像が撮れるようになります。
　N-SIMは販売開始から間もないうちに、雑誌「The Scientist」誌で2011年におけるトップイノベーションの第５位にランクインし、世界的に非常に注目が集まっております。

　N-SIMは、当センターのStation-5になりますので、機器の詳細はこちらをご覧ください。

構造化照明型超解像顕微鏡（N-SIM）で観察した動画

　上記のように、N-SIMでは、生きている細胞での高速画像取得から３次元モデルを作成したり、あるいはタイムラプス観察を行うことも可能です。そこで以下では、タイムラプス観察や、３次元モデルの動画を紹介いたします。当センターの超解像顕微鏡の利用を検討されている方は、ぜひご覧ください。

*Webサイトでの表示の関係上、ファイルサイズ軽減の目的で、解像度を大幅に下げておりますことは、ご容赦ください。

※以上の植物サンプルは、株式会社ヤガミの「植物組織プレパラート（40種）」（理科の実習用）になります。

ニコンの超解像顕微鏡：N-STORMに関して

※当センターには、「N-STORM」などの１分子局在化顕微鏡はございませんが、観察方法の紹介として以下に記します。

　通常の蛍光観察法では、「強い光の照射のため、Ｚ方向も含めた視野内の全分子が同時に励起する」ことになります。そのため上記に記した光学限界により、光学分解能の範囲内で近隣している蛍光分子を”分けること”ができず、「見えているものは、１個の粒子なのか？それとも近隣にある複数の粒子なのか？」の識別ができません。

　ニコンで展開しているN-STORMは、１分子局在化顕微観察法の一つにあたります。
　この１分子局在化顕微観察法は、光学系として全反射蛍光光学系（TIRF)をベースとしており、このためガラス基板のすぐ上の数百ナノメートルのみにしか励起光が届きません。そして励起光が当たっても、確率的にごく少数の蛍光分子のみが光る状態としておき、なおかつ極めて弱い光を励起光として照射して観察します。このため、蛍光を発する分子はごく低確率となりますので、分子１個に由来する蛍光画像が取得できます。この段階では光学分解能の観点から、実際の分子１個のサイズより遥かに大きな円が観察されますが、画像演算処理によって円の中心位置が算出できます。
　１分子局在化顕微観察法は、上記の原理で数千枚以上もの多くの画像を取得し、その個々の画像から個々の蛍光分子の位置を正確に把握した、高分解能の画像を再構築いたします（この原理が、平成26年のノーベル化学賞の対象となりました）。

*光る分子の割合が非常に小さいので、隣接する２分子が同時に蛍光を発する可能性は限りなく０に近く、そのため他の種類の光学顕微鏡では隣接する蛍光が重なり合って識別できなかったシグナルの分離・識別ができます。

また全反射光学系のため、ＸＹ位置が同じでＺ位置のみが異なる可能性も排除できます。
例としては―超高層ビルで「204号室」とだけ言われても、各階に204号室があるのなら１階か32階か、はたまた200階であるか判別できないですが、全反射光学系ではＺ位置は最初から特定されており、ガラス基板のすぐ上の１階だけが対象なので、「１階の204号室！」となります。

　ただしSTORMではTIRF光学系とする必要があるため、ガラス基板のすぐ上のみしか観察ができませんし、１枚の画像には僅かの分子の位置しか反映されない→数千枚の画像取得が必要となりますので、１枚の画像構築に数分程度の時間を要します。更に蛍光分子が光るか否かは、分子構造や化学平衡に大きく依存しております。実際に蛍光分子の大部分を光りにくくするためには、還元剤を投与して高精度に化学平衡を調節する必要があり、この場合は生きた細胞試料の観察はできません。

　このため現状では、まだ発展途中の手法であり、細胞内小器官や生体分子の位置をリアルタイムに把握することは、現在では”誰でも可能”とは言いがたいです。しかし従来の十分の一、20nmという超高分解能が達成できますのは、非常に大きなメリットです。日常的に電子顕微鏡用のサンプルを作成して観察を行っているような方ですと、STORM用サンプルの作成は容易です。
　もちろん試薬やカメラ、あるいはソフトウエアの開発で、飛躍的に観察手法が改善される可能性が高いですので、ぜひ今後に期待してくださればと思います。当初このページを作成した平成24年・26年と比較しても、数年で大幅に改善された点も多々あり、近い将来には生きた細胞での観察も行えるようになると推測されます。

*観察方法や詳細は、上記のリンク先や、[Nikon: Single-Molecule Super-Resolution Imaging]（こちらは英語です）などを、ぜひ参考としてください。

また当センターでは、画像解析による超解像化：SRRFについても、紹介を行っております。
SRRFの詳細は以下をご覧ください。